Pre-incubation of porcine semen reduces the incidence of polyspermy on embryos derived from low quality oocytes / Pré-incubação dos espermatozoides suínos diminui polispermia e aumenta a produção embrionária em oócitos de baixa qualidade

ABSTRACT: The main cause of low efficiency of in vitro produced porcine embryos is the high polyspermic penetration rates at fertilization, which is aggravated in low quality oocytes. Experiment 1 evaluated the embryo development in high and low quality oocytes. Experiment 2 evaluated the embryo development and quality of low quality oocytes fertilized with sperm pre-incubated during 0h (control), 0.5h, 1h and 1.5h. Experiment 3 investigated fertilization and monospermic rates of the same groups of Experiment 2. Experiment 4 evaluated embryo development, cell density, fertilization and monospermic rates of high quality oocytes using semen pre incubated during the best time observed in the previous experiments. Cleavage and blastocyst rates were analyzed by chi-square test, and remaining data by ANOVA and Tukey test (P≤0.05). The cleavage (74.8 vs 51.7%) and blastocyst (33.7 vs 9.8%) rates were greater in oocytes of high versus low quality, with no differences in cell density. Fertilization rates (65.6 to 79.5%) were not influenced by pre-incubation time. However, semen pre-incubation during 1.5h increased monospermic penetration (53.3%) and cleavage rates (92.5%) in low quality oocytes. Blastocyst rate was improved with 1.5h of semen pre incubation; however they were still lower than that observed with high quality control oocytes. Ultimately, pre-incubation did not influence fertilization, monospermic penetration, embryo development rates, nor cell density in oocytes of high quality. Low-quality porcine oocytes resulted in better rates of embryo development if in vitro fertilized with sperm pre-incubated for 1.5 hour.

RESUMO: A principal causa da baixa eficiência na PIV de embriões suínos é a elevada taxa de polispermia, que é exacerbada em oócitos de baixa qualidade. O experimento 1 avaliou o desenvolvimento embrionário de oócitos de baixa e alta qualidade. O experimento 2 avaliou a qualidade e o desenvolvimento embrionário de oócitos de baixa qualidade fecundados com sêmen pré-incubado por 0h (controle), 0,5h, 1h e 1,5h. O experimento 3 investigou a fecundação e as taxas de monospermia dos mesmos grupos do experimento 2. O experimento 4 avaliou o desenvolvimento embrionário, a densidade celular, a fecundação e as taxas de monospermia de oócitos de alta qualidade, fecundados com sêmen pre-incubado com o melhor tempo observado nos experimentos anteriores. As taxas de clivagem e de blastocistos foram submetidas ao teste de Qui-quadrado e os demais dados submetidos à ANOVA e teste de Tukey (P≤0,05). As taxas de clivagem (74,8 vs 51,7%) e de blastocistos (33,7 vs 9,8%) foram superiores nos oócitos de alta qualidade, comparados aos de baixa qualidade, não havendo diferenças na quantidade de células embrionárias. As taxas de fecundação (65,6 vs 79,5%) não foram influenciadas pelo tempo de pré-incubação. Todavia, a pré-incubação do sêmen por 1,5h aumentou a penetração monospérmica (53,3%) e a taxa de clivagem (92,5%), nos oócitos de baixa qualidade. As taxas de blastocisto aumentaram com sêmen pré-incubado por 1,5h, que foram ainda inferiores às obtidas dos oócitos de alta qualidade do grupo controle. Finalmente, a pré-incubação do sêmen não influencia na fecundação, na penetração monospérmica, no desenvolvimento embrionário, nem na quantidade de células embrionárias com oócitos de alta qualidade. Oócitos suínos de baixa qualidade produzem melhores taxas de desenvolvimento embrionário se fecundados in vitro com sêmen pré-incubado por 1,5 horas.

Microbiological and functional evaluation of an alternative device (OB®) for estrous synchronization in ewes / Avaliação microbiológica e funcional de um dispositivo vaginal alternativo (OB®) para sincronização de cio em ovelhas

The use of synthetic progestagens released by vaginal devices is an important tool to overcome the reproductive seasonality in sheep, but cost and/or subsequent vaginitis are limiting factors for their use. To identify economic, simple and innocuous alternative vaginal devices for estrous synchronization/induction protocols in sheep, this study aimed to evaluate the microbiological and functional viability of the human vaginal tampons (OB®) impregnated with medroxyprogesterone acetate (MAP) on reproductive performance of ewes. The study compared them with commercial vaginal inserts (CIDR®) and polyurethane sponges impregnated with MAP. In Experiment 1, the device loss rate, the degree of vaginitis during the device removal, the count and identification of bacterial colonies at the device insertion and removal, and efficiency in estrous synchronization and estrus temporal distribution were evaluated. Pubertal ewes at the beginning of the breeding season were randomly allocated to three experimental groups: CIDR®, PSP (polyurethane sponge) and OB®. No device losses occurred in any group, but the use of OB® caused milder signs of vaginitis than polyurethane sponges, with a similar vaginal bacterial growth and microbiota than the CIDR group. The estrus distribution was more disperse in the CIDR than PSP or OB groups. In Experiment 2, pregnancy rates using CIDR® or OB® devices were compared, with estrus manifestation (85.4 percent and 89.8 percent) and pregnancy rates (58.3 percent and 49.0 percent) being similar between groups (P>0.05), respectively. In conclusion, the use of human intra-vaginal tampons (OB®) impregnated with MAP was proven highly hygienic, practical and effective as a low-cost alternative for estrous synchronization and AI in sheep.

O uso de progestágeno sintético liberado por pessários vaginais é uma importante ferramenta para suplantar a sazonalidade reprodutiva em ovelhas. Todavia, seu uso é limitado pelo custo ou pelas subsequentes vaginites. Na busca de uma alternativa simples e de baixo custo para sincronizar estro em ovelhas, este estudo avaliou o tampão vaginal humano (OB®) impregnado com MAP, na performance reprodutiva de ovelhas, comparando com o CIDR® e as esponjas de poliuretano, estas também impregnadas com MAP. No experimento 1 foram avaliados a taxa de perdas; o grau das vaginites no momento da remoção do pessário; a contagem e identificação das colônias bacterianas; bem como a eficiência da sincronização e a distribuição temporal dos cios. As ovelhas foram aleatoriamente distribuídas em um de três grupos experimentais: CIDR, Esponjas e OB, no inicio da estação reprodutiva. Não ocorreram perdas de pessários em qualquer grupo, porém o OB causou menor grau de vaginite em relação às esponjas, com um crescimento bacteriano e microbiota similares ao grupo CIDR. A distribuição dos cios foi mais dispersa no grupo CIDR do que nos grupos Esponja ou OB. No experimento 2, foram comparados o CIDR e OB em relação à manifestação de cio (85,4 por cento e 89,8 por cento) e taxa de prenhez (58,3 por cento e 49,0 por cento), que foram similares (P<0,05). Conclui-se que o pessário OB impregnado com MAP é higiênico, de baixo custo, prático e efetivo como para a sincronização de cios e IA em ovelhas.

Vacuum-cooled liquid nitrogen increases the developmental ability of vitrified-warmed bovine oocytes

The objective of this study was to determine the effects of vacuum-cooled liquid nitrogen on the development of vitrified immature (germinal vesicle stage; GV) and mature (metaphase II; MII) bovine oocytes after re-warming. Liquid nitrogen was exposed to either atmospheric pressure or to a vacuum (300mm Hg for 45sec); the latter decreased the temperature of the liquid nitrogen to -200°C. Partially denuded oocytes were vitrified either just after selection (GV) or after 22 hours of in vitro maturation (MII) in TCM 199 medium + 10 percent of estrous mare serum. For vitrification, oocytes were firstly exposed to an intermediate solution (10 percent EG + 10 percent DMSO) for 30sec, followed by the vitrification solution (20 percent EG + 20 percent DMSO + 0.5M sucrose) for 20sec. Groups of three or four oocytes were loaded into an open-pulled-straw and directly plunged into liquid nitrogen. Oocytes were subsequently re-warmed by exposure to air (25°C) for 4sec, followed by 5 min exposure to decreasing concentrations (0.3 and 0.15M) of sucrose. Fertilization (Day 0) was done with 2 x 106 spermatozoa mL-1 (selected by a swim-up procedure) and incubated for 18 to 22 hours. Presumptive zygotes were cultured at 39°C in four-well dishes with SOFaaci medium, under 5 percent CO2 and saturated humidity. Cleavage (Day 2) and blastocyst rates (Day 8) were 33.9 and 4.2 percent, respectively, for GV stage oocytes at atmospheric pressure, 41.2 and 8.8 percent for GV oocytes under vacuum, 43.5 and 6.7 percent for MII oocytes at atmospheric pressure, and 53.6 and 10.6 percent for MII oocytes under vacuum. In conclusion, vacuum-cooled liquid nitrogen improved developmental rates of vitrified-thawed bovine oocytes.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito do nitrogênio liquido super resfriado por vácuo no desenvolvimento, após reaquecimento, de oócitos bovinos vitrificados imaturos ou maturados. O nitrogênio líquido foi mantido em atmosfera normal ou submetido ao vácuo (300mm Hg por 45s) este último reduzindo a temperatura do nitrogênio para -200°C. Oócitos parcialmente desnudos foram vitrificados logo após a seleção (estádio de vesícula germinativa; VG), ou após 22 horas de maturação (metáfase II; MII) em meio TCM 199 + 10 por cento de soro de égua em estro. Para a vitrificação, os oócitos foram inicialmente expostos a uma solução intermediária (10 por cento EG + 10 por cento DMSO) por 30s e a seguir a uma solução de vitrificação (20 por cento EG + 20 por cento DMSO + 0,5M sacarose) por 20s. Grupos de 3 ou 4 oócitos foram envasados em palhetas estiradas e abertas e mergulhados no nitrogênio líquido. Os oócitos foram então reaquecidos por exposição ao ar (25°C) por 4s, seguido de exposição a concentrações decrescentes de sacarose (0,3 e 0,15M - 5 minutos cada). A fecundação (dia 0) foi realizada com 2 x 106 espermatozóides mL-1 (selecionados por "swim-up") e incubação por 18 a 22 horas. Os presumíveis zigotos foram cultivados a 39°C, em placas de quatro poços, com meio SOFaaci, com 5 por cento de CO2 e umidade saturada. As taxas de clivagem (Dia 2) e de blastocistos (Dia 8) obtidas foram de 33,9 e de 4,2 por cento, respectivamente, para oócitos no estágio de VG / pressão normal, de 41,2 e 8,8 por cento para oócitos VG / vácuo, 43,5 e 6,7 por cento para oócitos MII / pressão normal e de de 53,6 e 10,6 por cento para oócitos MII / vácuo. Conclui-se que o emprego de nitrogênio líquido super resfriado pelo vácuo melhora as taxas de desenvolvimento de oócitos bovinos após a vitrificação.

Produção in vitro de embriões bovinos com soro de égua ou de vaca em estro com ou sem a adição de LH/FSH / In vitro production of bovine embryos with oestrus mare's serum or oestrus cow serum with or without LH/FSH

Mil duzentos e setenta e um oócitos foram divididos em 4 tratamentos com a finalidade de se avaliar a influência da adição de LH e FSH na produção in vitro de embriões bovinos com soro de vaca em estro (SVE) ou soro de éguas obtido no 1º dia do estro (SE). Independente do tratamento os oócitos foram maturados com TCM199 + 5,95mg/ml de Hepes, 0,025mg/ml de piruvato de sódio e 2,2mg/ml de bicarbonato de sódio, sendo adicionado 10 por cento de soro de égua (ES), 10 por cento de SVE (VS), 10 por cento de soro de égua + 0,5mg/ml de hormônio luteinizante bovino (LHb) + 0,01UI/ml de hormônio folículo estimulante recombinante humano-rFSHh (EH) e 10 por cento SVE + LHb + rFSHh (VH). Os oócitos assim tratados, foram maturados em estufa com 5 por cento de CO2 a 39ºC sob umidade saturada por 22-24h. Depois, foram fecundados em TALP-FERT por 18-20h e cultivados por 8 dias em meio SOF + 5 por cento de SE (ES e EH) ou SVE (VS e VH). As taxas de clivagem de 72 por cento obtidas no grupo VH (229/316) e 61 por cento no grupo VS (193/315) foram significativamente menores (p<0,05) que as dos grupos ES (80 por cento - 254/317) e EH (80 por cento - 257/323). A produção de embriões (blastocistos iniciais, blastocistos, blastocistos expandidos e eclodidos) no D7 após a inseminação para os grupos ES (32 por cento), EH (28 por cento) e VH (27 por cento), foi significativamente superior aos 20 por cento obtidos no VS (p<0,05). No D9, verificou-se uma diferença significativa (p<0,05) entre os grupos ES (31 por cento) e EH (29 por cento) quando comparados com o grupo VS (22 por cento), mas não houve diferença quando comparamos com o VH (24 por cento). A taxa de eclosão em D9 foi de 11 por cento (ES), 11 por cento (EH), 10 por cento (VS) e 5 por cento (VH). Não houve diferença entre as médias do número de células dos embriões (Blastocistos expandidos e eclodidos) obtidos no D9. Conclui-se, com estes resultados que, para a obtenção de taxas regulares de blastocistos, não seja necessária a adição de hormônios quando se utilize o soro de égua, e que os hormônios devam ser adicionados quando se utilize soro de vaca.

Transporte de oócitos bovinos em meio de maturaçäo sem controle de atmosfera gasosa / Transport of bovine oocytes in maturation medium without a controlled gaseous atmosphere

Oócitos (n=1177) bovinos obtidos da aspiraçäo de folículos com diâmetro entre 2 e 8mm, de ovários de matadouro foram divididos aleatoriamente em quatro tratamentos com 11 repetiçöes. Os oócitos foram maturados por 24h em TCM-199 Sais de Earle, acrescido de 25mM de bicarbonato de sódio, 25mM de HEPES, rFHS-h, Soro de Vaca em Estro (SVE) e piruvato, em estufa a 39ºC, com 5 por cento de CO2 em ar e umidade saturada (Grupo Controle, n=296) ou, submetidos ao transporte simulado por 6 (T6, n=286), 12 (T12, n=294) ou 18h (T18, n=301) em meio de maturaçäo TCM+HEPES, em banho-maria a 39ºC, com os mesmos componentes utilizados para o Grupo Controle, porém com apenas 1mM de bicarbonato. Decorrido cada período de transporte, os mesmos foram transferidos para placas com meio de maturaçäo, completando o período de 24h em estufa, nas mesmas condiçöes do Grupo Controle. O período de fecundaçäo foi de 18h em condiçöes semelhantes de temperatura e atmosfera gasosa, em FERT-TALP acrescido de heparina, sendo a dose inseminante de 1x106 espermatozóides/mL, selecionados por migraçäo ascendente. Os prováveis zigotos foram cultivados em meio SOF + 5 por cento SVE por 8 dias, em estufa a 39ºC, em bolsas gaseificadas com 5 por cento CO2, 5 por cento O2 e 90 por cento N2. Na avaliaçäo da clivagem, näo houve diferença entre os tratamentos. As taxas de desenvolvimento embrionário no dia 7 foram semelhantes para os grupos Controle (20,9 por cento), T6 (19,2 por cento) e T12 (21,4 por cento), com uma reduçäo (P<0,05) observada no grupo T18 (12,3 por cento), em relaçäo aos grupos Controle e T12. No dia 9, o T18 apresentou uma menor (P<0,05) produçäo de blastocistos expandidos mais eclodidos, em relaçäo aos demais grupos, embora näo tenha sido observada diferença (P>0,05) na taxa de eclosäo. O número médio de células dos blastocistos eclodidos näo diferiu (P>0,05) entre os grupos Controle (136), T6 (125,5) e T12 (126,8). Esses resultados indicam a possibilidade do transporte de oócitos bovinos em meio de maturaçäo TCM+HEPES, sem controle da atmosfera gasosa, a 39ºC, pelo período de até 12h. Esta técnica oferece uma alternativa prática e eficiente para o transporte dos oócitos bovinos destinados à produçäo in vitro de embriöes bovinos (PIV).

Etileno glicol na criopreservaçäo de sêmen canino / Ethylene glycol on canine semen cryopreservaton

O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilizaçäo do etileno glicol, adicionado ao meio Tris-gema, na criopreservaçäo de sêmen canino, considerando os seus efeitos sobre a motilidade, o vigor e a morfologia espermática pré e pós-congelamento. Como doadores, utilizaram-se quatro cäes da raça Pastor Alemäo coletados por manipulaçäo digital os quais no ejaculado apresentaram padröes mínimos de 90 por cento de motilidade, cinco de vigor espermático (0 - 5) e no máximo 35 por cento de defeitos morfológicos totais. As concentraçöes de etileno glicol testadas foram de 0, 25; 0,5 e 1,0M, sendo empregados como controle 0,8M de glicerol. Foram feitas cinco avaliaçöes de motilidade e vigor, respectivamente, na obtençäo da fraçäo rica, depois da primeira diluiçäo, ao atingir 4°C, após uma hora de estabilizaçäo a 4°C e no descongelamento. Avaliou-se a morfologia espermática em sêmen a fresco e após o descongelamento das amostras de cada tratamento. Näo houve diferença na motilidade e na morfologia espermática dos grupos após o descongelamento. No vigor espermático pós- descongelamento, as concentraçöes de 0,25 e 0,5M de etileno glicol foram semelhantes entre si e com a concentraçäo de 0,8M de glicerol (controle), mas diferiram da concentraçäo de 1M, a qual apresentou vigor inferior ao controle. Conclui-se que, para a criopreservaçäo de sêmen canino, o glicerol 0,8M pode ser substituído pelo etileno glicol nas concentraçöes de 0,25, 0,5 e 1,0M

Vitrificação de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro e expostos à citocalasina B / Vitrification of oocytes and in vitro produced bovine embryos exposed to cytochalasin B

Foi avaliada a influência da citocalasina B na vitrificação de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro. No Experimento I, 956 oócitos foram maturados por 22h, sendo imediatamente vitrificados (tratamento Vitri) ou expostos por 15 a 20 minutos, à solução com 7,5µg/mL (tratamento CB7,5Vitri) ou 45µg/mL (tratamento CB45Vitri) de citocalasina B, antes da vitrificação. Após 30 segundos de exposição à SV1 [400µl TCM-Hepes com 10 (por cento) soro fetal (SF), 50µl etilenoglicol (EG) e 50µl DMSO], e 20 segundos à SV2 (300µl trealose 1,0M + 20 (por cento) SF, 100µl EG e 100µl DMSO), os oócitos foram vitrificados em palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi realizado a 37-38ºC em duas etapas de 5 minutos cada, em trealose 0,3M e 0,15M. Não houve diferenças (P>0,05) nos percentuais de clivagem e desenvolvimento embrionário entre os tratamentos Vitri, Cito7,5Vitri e Cito45Vitri, os quais foram inferiores (P<0,05) ao controle. No Experimento II, 269 blastocistos expandidos foram distribuídos em 3 tratamentos. No tratamento Vitri, os embriões foram expostos por 1 minuto à SV1 e 20 segundos à SV2, a qual foi modificada pela substituição da trealose por TCM-Hepes. No tratamento CB45Vitri, a vitrificação ocorreu após exposição de 10 minutos à solução com 45µg/mL de citocalasina B. Não foram observadas diferenças (P>0,05) no percentual de re-expansão e eclosão entre os grupos Vitri e CB45Vitri, os quais foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle. Os resultados indicam que, independentemente da dose utilizada, a exposição a citocalasina B não produz efeito benéfico na vitrificação de oócitos ou blastocistos bovinos produzidos in vitro

Cultivo individual de blastocistos bovinos produzidos in vitro / Individual culture of in vitro produced bovine blastocysts

Embriöes bovinos produzidos in vitro foram cultivados individualmente do D7 ao D9, com o intuito de avaliar o seu desenvolvimento posterior. Quarenta e nove embriöes, nos estágios de blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido foram cultivados, individualmente, em 50ml de meio SOF + 5 por cento SVE, do D7 ao D9 (D0=fecundaçäo). Entre o D7 e D8, os blastocistos foram cultivados em palhetas (TcP) ou em placas (CP) e, entre o D8 e D9, foram cultivados apenas em placas. O índice de blastocistos que avançaram pelo menos um estágio de desenvolvimento, entre D7 e D8, foi de 71 por cento, 37 por cento e 44 por cento no CP e de 100 por cento, 66 por cento e 36 por cento no TcP, respectivamente para blastocistos iniciais, blastocistos e blastocistos expandidos. O percentual total de embriöes que evoluíram do D7 para D8 foi de 50 por cento (12/24) para o CP e de 60 por cento (15/25) para o TcP, os quais näo foram significativamente diferentes (P>0,05). Na avaliaçäo efetuada no D9, näo foram constatadas diferenças (P>0,05) no percentual de blastocistos eclodidos, entre os dois sistemas de cultivo (29 por cento e 24 por cento para CP e TcP, respectivamente). Após coloraçäo fluorescente dos núcleos, näo foi observada diferença (P>0,05) entre o número médio de células dos blastocistos eclodidos (182,66 vs. 202,8) e expandidos (94,5 vs. 88), para o CP e TcP, respectivamente. Blastocistos bovinos produzidos in vitro podem ser cultivados individualmente do D7 ao D9, näo havendo efeito do sistema de cultivo empregado (placas ou palhetas) sobre a taxa de eclosäo e o número de células